抑癌基因p53提高人胃癌细胞热敏感性的作用

门诊时间：08:00-18:00 疾病疑问咨询入口

　　作者：张珊文/肖卫群/吕有勇 来源：《中华物理医学与康复杂志》2000年第22卷

　　【摘要】目的 评价抑癌基因p53对人胃癌细胞((BGCX23)热敏感性的影响。方法4种不同p53基因状态的人胃癌细胞系始终用于本实验。用流式细胞光度术(FCM)分析加热42℃ 2h或43℃30min后，在37℃下培养8h或16h, 4种细胞系细胞周期分布和凋亡的反应。以43℃ 20min两次加热后的种植肿瘤的和制曲线比较4种细胞的热敏感性。结果 在37℃正常条件下，4种细胞系细胞周期各时相比例都没有明显的差异。加热42℃ 2h或43℃ 30min后37℃的恢复8或16h. P53正常的wtp53细胞出现强烈的S期阻滞、而且，恢复16h该细胞出现明显的预示凋亡的亚G1峰;而在同样条件下，其他3种p53异常的细胞系S期比例没有显著的变化(P>0. 05),且都没有出现亚G1峰。两次加热wt53细胞种植肿瘤生长比其他3种细胞肿瘤更明显受到抑制(P<0. 05)。结论 以上结果证实了p53基因促进了加热后肿瑕细胞的S期阻滞和凋亡，从而明显地提高肿瘤细胞的热敏感性。

　　【关键词】胃肿瘤 基因 p53 调亡 热敏感性

　　Enhancement effect of the tumor suppressor p53 gene on themosensitivity of buman gastric cancer cell lines Zhangshanwen, XIAO weiqun, LU Youyong. Deparztmemt of Radutherapy, the school of oncology.Beijing Medical univuersity. Beiying 100036, china.

　　【Abstract】 objective To assess the role of the turror suppressor p53 gene on thermosensitivity of human gasuric cancer cell lines(bgc823). Methods Four human gastric cancer cell lines with different p53 status were used throught out this study. Cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry of cell in 8 hct 16h at 37 ℃ after hest treatment at 42 ℃ for 2 h or 43℃ for 30 min. Plating them into the nude mices, camparing relative volume growth curve after heating at 43℃ for 20 min 1wice. Results Bgc823-wtp53 cell with nmormal p53 had strong arrest in S phase following recover in 8 h or 16 h at 37℃ after heat treatment at 42℃ for 2 h or 43 t' for 30 min. And a sub-g1 peak of apoptosis could be observed fol owing recover in 16 h at 37T after heat tire at ment at 42 C for 2 h or 43 ℃ for 30 min. While other three cell lines with ab no mal p53 had almost no arrest in S phase and no a poptotic response following same condition. Turxr of Bgc823wtp53 cells after heat treatment at 43 C for 20 min twice sign mi fi cant ly was inhibited than those of other three cell lines( P<0. 05). Conclusiona These results suggs t that wild-type p53 gene prc mx ote S phase arrest and appuosis of tumor cells following heat shock. And therefore enhance intrinsc the r mx sensitivity of turn xor cell.

　　【Key word】 stonech heoplasms;gene. P53;apoptosis;Thermasensitivty.

　　野生型p53(正常p53)促进热引起的细胞周期阻滞和凋亡，而p53基因缺失或变异将会减弱甚至破坏这些热效应[1-3]。p53异常频率约占各种肿瘤的50%，这是肿瘤细胞热疗疗效降低的内在原因之一。为了进一步确定p53基因对肿瘤细胞热敏感性的影响，我们分析了加热后4种不同p53状态的人胃癌细胞系的细胞周期变化和凋亡，并评价了该4种细胞的热敏感性，为下一步用腺病毒携带p53悬液提高热疗疗效的临床前研究提供可靠的实验依据。

1、材料和方法

1.1细胞系

　　通过脂质体介导的野生型p53基因质粒、突变型p53基因质粒和无p53的空载质粒转移进有p53基因缺陷的人胃腺癌BGC823细胞中，其中转录野生型p53为Bgc823-wtp53细胞(略为wtp53),转录突变型p53为Bgcx23-mutp53细胞(略为mutp53),转录无p53空载质粒为Bgc823-vect细胞(略为vectp53),本院肿瘤分子生物学实验室构建了这3种细胞，并用PCR等法鉴定了3种基因转录的稳定性[4]。以上3种被转录的细胞及其亲本人胃腺癌BCC823细胞(略为BGC823)一并用于本实验中。

1.2细胞培养和加温实验

　　细胞培养在DMEM-10的培养基中，该培养基含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和50U/ml链霉素，并置于5%二氧化碳的37℃恒温孵育箱中。每1培养瓶内种植106细胞，翌日拧紧瓶盖，并将培养瓶塑封后浸泡于恒温水浴中(JULABOLGMBH型水浴锅，控温误差(±0.03℃)42℃2h或43℃30min, 1加温后培养瓶内换以新鲜培养基，并置于37℃恒温孵育箱中)。

1.3流式细胞光度术分析

　　37℃正常条件下和加热后在37℃恒温孵育箱中分别放置8h或16h后收获细胞，行流式细胞计分析(FACS240型)，测定细胞DNA含量，并勾画出细胞周期分布的直方图(方法如文献[2.3.5])，在G0)/G1峰前出现独特的亚二倍体细胞的Subg峰被确定为特异的伴DNA降解的凋亡细胞峰[2,3,5]。以上实验各组和各时间点都是2个以上培养瓶，并重复实验2次以上。

1.4肿瘤热抑制曲线

　　选用雌性裸鼠，6周龄，体质量20～25g，用于本实验。以上4种细胞的单细胞悬液0.2ml(细胞数106)注射于裸鼠右下肢腹股沟皮下。肿瘤长至7～10mm时，麻醉后将裸鼠固定，将荷瘤下肢浸泡于43℃恒温水浴中20min,隔天重复加温1次。用油标卡尺量取瘤体的两个直径，以公式:体积=π/6|(直径1+直径2)/2³，计算肿瘤体积。以观察天数为横坐标，以加热当日的肿瘤体积为1，以肿瘤体积增加的倍数(即相对体积)为纵坐标，将对应于观察天数的相对体积点连接为肿瘤热抑制曲线。每次实验每种细胞种植裸鼠4只，并重复3次。

2、结果

2.1 4种细胞37℃正常条件下16h的细胞周期分布和凋亡的直方图(图1)，如图1中的A、B、C、D所示:G0/G1、S1和G2/M期峰都相似，G0/G1,峰前都没有出现Sub-g1;峰。加热43℃30min后，37℃恢复16h,3种p53异常的mutp53、 vectp53和BGC823细胞的细胞周期分布和凋亡的直方图，如图1中的F、G、H图所示，与图1中的B、C、D相似;只有E图显示:加热43℃30min后37℃恢复16h, wtp53细胞G2/M期峰明显变小，S期峰明显增大和在G0 /G1峰前出现Sub-G1峰(42℃ 2h后16h结果与之相似)。而42℃ 2h或43℃ 30min后8h的结果也和图1 E、F、G、H图所示一样，只有wtp53细胞显示G2/M期峰明显变小，S期峰明显增大，而在G0/G1峰前尚未出现Subgi峰。

2.2 4种细胞37℃正常条件下和加热条件下的细胞周期各时相比例和调亡细胞比例(表1)显示:4种细胞37℃正常条件下G0/G1、S1和G2/M期比例无明显差异(P>0. 05),凋亡细胞都为0。仅有wt153细胞在两种温度加热后8或16h细胞时相比例出现明显变化，G2/M期比例明显减小(P<0. 05), S期比例明显增加(P<0. 05)到占原细胞总数的53.5%和53.0%(42℃2h后8和16h),和占原细胞总数的50.0%和47.2%(43℃30min后8和16 h),比同样加温条件下其他3种细胞的S期比例明显增高(P<0. 05)。

　　wp53细胞42℃2h和43℃30min后16h还出现明显的凋亡效应，凋亡细胞分别达10.5%和12.3%。而其他3种细胞同样条件加温后细胞各时相比例无明显变化，凋亡细胞比例都为0(表1仅列mutp53细胞数据，vctp53和BGC823细胞数据与之相似)

2.3 4种细胞种植肿瘤1周两次43℃20min加热后肿瘤抑制曲线(图2)显示:wtp53细胞肿瘤加热后生长缓慢，到第20天仅增大了1倍，而其他3种细胞肿瘤同样加热后增长很快，到第20天增大了2.7-3.6倍，生长速度显著地高于wtp53细胞(P<0. 05)。

3、讨论

　　具有正常p53功能的wtp53细胞42℃2h或43C 30 min后8h或16h的S期比例明显增加，出现了明显的S期阻滞，两种温度加热后16h还出现明显的凋亡效应，凋亡细胞分别达11%和12%。而其他3种p53异常的细胞都没有出现S期阻滞和凋亡效应。S期阻滞和凋亡都可以作为肿瘤细胞对热的反应的机制，而p53正是通过延长热产生的S期阻滞和凋亡来提高肿瘤细胞的热反应性，4种细胞肿瘤加热后肿瘤抑制曲线表明:wtp53细胞的热敏感性高于另3种p53异常的细胞。我们的结果与国外的报告结果一致[1-3]。我们所用的wp53细胞是有p53缺陷的人胃癌细胞系转录入外源性野生型p53基因的细胞，实验证实外源性野生型p53基因明显地提高了wtp53细胞的热敏感性。这种外源性野生型p53基因转录的方法已成为提高肿瘤热疗疗效的基因治疗的新策略，本实验结果为热疗的基因治疗提供了可靠的依据。

　　参考文献

　　[1].Hhayosh S, kabo E, mnsumtoh, I4 al. Thermxeocnsitivity, inuienced,学po四验and cum sst d M? Mnd53p应asd mring-ctll in wild type status of p53 gene. J Exp cln cancer Res、1999, 18;181-189.

　　[2].Matumou H, taka hash A, wang X, et al. Transfectin of p53--WC223kru c kut mx use fi bru blasts with wnld-type p53 increases thethe mos en st iv it y and stimulates a pop to sns induced by bent s tres int JRsdiat ocol Bgol phys. 1997. 39:197-203

　　[3].zhu WG. Arertak R、coos Y, ct al prc out in uf heat-inducedapoptosis in FM3A cells by pho-tease inhibitors. Birchem and BeophysRescowm,

　　[4].孙悔，日有勇.外源性p53基因对人胃癌细胞患性增硫的影响，科学通指，1996，41:823-825.

　　[5].张珊文，肖卫群，吕有勇 抑癌基因p53对人胃稿细胞系改射敏感性的作用中华教射肿瘤学杂志，I999, 8:116-119.(收篇日期:1999-05-17)

• 没有了！
• 甘氨双唑钠对恶性肿瘤放射增敏的临床研究